离心技术的原理是物体在匀速圆周运动时受到一个外向的离心力,将样品放入离心机转子的离心管内,样品液就随离心管做匀速圆周运动,产生了一个向外的离心力。
密度梯度离心,又称为速率区带离心,是沉降系数较接近的物质分离的方法。
工作原理:不同颗粒之间存在沉降系数差时,在一定离心力作用下,颗粒各自以一定速度沉降,在密度梯度不同区域上形成区带的方法。
介质梯度应预先形成,介质的密度要小于所有样品颗粒的密度。
常用介质:蔗糖、甘油;
密度梯度液的制备用梯度混合器,形成由管口到管底逐步升高的密度梯度;
具体操作流程:离心前将样品小心铺放在密度梯度溶液表面,离心形成区带。离心后不同大小、不同形状、有一定沉降系数差异的颗粒在密度梯度液中形成若干条界面清楚的不连续区带;
应用范围:可用来分离核酸、蛋白质、核糖体亚基及其它成分。
(一)浓缩的基本原理蒸发浓缩可在沸点或低于沸点时进行,又可在减压或常压下进行。为提高蒸发效率,生产上蒸发浓缩均采用沸腾蒸发。沸腾蒸发浓空的效率常以蒸发器真空离心浓缩仪生产强度来衡量。蒸发器生产强度是指单位时间内,单位传热面积上所蒸发的溶剂量。
(二)影响浓缩的因素
1.传热温度差(△t)的影响 提高加热蒸汽的压力和降低冷凝器中二次蒸汽的压力,都有利于提高传热温度差。
2.总传热系数学(K)的影响 一般地说,增大总传热系数是提高蒸发浓缩效率的主要途径。由传热原理可知,增大K的主要途径是减少各部分的热阻。管内溶液侧的垢层热阻(RS)在许多情况下是影响K的重要因素,尤其是处理易结垢或结晶的物料时,往往很快就在传热面上形成垢层,致使传热速率降低。为了减少垢层热阻,除了要加强搅拌和定期除垢外,还可从设备结构上改进
操作步骤:
1.成年鼠肝匀浆2000xg(约4000rpm) 离心15分,4℃(6×50ml高速转头)
2.沉淀用1mM NaHCO3 稀释再在4000rpm离心15分,4℃
3.沉淀按湿重1g/ml NaHCO3 稀释后配成68%蔗糖液,置于离心管下部,上部用42%蔗糖液
4.6×50ml高速转头,42200xg(18000rpm),4℃离心90分钟,加速“5”减速“5”
5.离心后,粗制细胞膜在42%与68%蔗糖液之间形成
6.粗制细胞膜吸出后,用1mM NaHCO3 稀释后,再以2000xg(约4000rpm)4℃离心30分,重复二次
7.去除上清液沉淀,再用1mM NaHCO3 稀释,在50ml 离心管中,从底部依次向上铺设:68%蔗糖液(稀释样品配成)、48%蔗糖液、42%蔗糖液。
8.铺好后再次离心,6×50ml高速转头,18000rpm,4℃,90分钟,加速“5”减速“5”
9.离心结束后可以看出细胞膜分布在42%与48%蔗糖液之间
成果:阶梯形蔗糖梯度在50ml 离心管中用高速冷冻离心机分离亚细胞构造(膜、线粒体、溶酶体、高尔基复合体、微体等),由于开发了高强度的组培养管而变得更为可行。